Introducción. Sospechar y confirmar la presencia del virus influenza AH1N1PDM09 en casos con infección respiratoria aguda fueron aspectos claves de la vigilancia de laboratorio durante la pandemia. Objetivo. Caracterizar las muestras positivas a virus influenza AH1N1PDM09 identificadas de pacientes de Santiago de Cuba durante el periodo 2009-2010. Métodos. Estudio descriptivo, transversal, retrospectivo, que caracterizó según variables clínicas, epidemiológicas y microbiológicas al 100% de las muestras confirmadas positivas a virus influenza AH1N1PDM09, procedentes de pacientes sospechosos de enfermedad tipo influenza durante el curso de la pandemia. Se usó el cálculo de frecuencia absoluta y relativa. Los resultados se expresaron en porcentaje. Resultados. Las muestras positivas a AH1N1PDM09 correspondieron más frecuentemente al sexo femenino (67%) y a jóvenes y adultos jóvenes (49,4%). Los picos temporales de mayor identificación de muestras positivas ocurrieron en octubre de 2009 y julio de 2010. El 79% de las muestras positivas se obtuvo entre los 0 y 3 días de la fecha de inicio de los síntomas. Tos (93%) y fiebre (87%) fueron los síntomas y signos predominantes para todos los grupos de edades en las muestras positivas a AH1N1PDM09. La mayor frecuencia de positividad se obtuvo de la vigilancia de no graves (58%) y la más baja en casos con infección respiratoria aguda grave. La disnea fue un síntoma muy frecuente en los casos graves (75%). Conclusiones. La confirmación virológica de virus influenza AH1N1PDM09 en Santiago de Cuba, aportó una importante herramienta en el manejo clínico-epidemiológico de los casos durante el curso de la pandemia.